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伤寒Vi多糖柱层析纯化工艺的优化

摘要

目的:优化伤寒Vi 多糖柱层析纯化工艺,以替代传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法。方法:采用DEAE 离子交换层析柱,分别在缓冲液(20 mmol/L Tris-ClpH 值为6. 07. 0 8. 0 的条件下纯化1 批伤寒Vi 多糖粗糖,并与传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法进行比较。按《中国药典》三部(2010 版)要求检测纯化样品的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大小及内毒素含量,并计算样品的多糖回收率。采用优化的DEAE 柱层析纯化工艺纯化3 批伤寒Vi 多糖粗糖,验证该工艺的稳定性。结果DEAE 离子交换柱缓冲液(20 mmol /L Tris-ClpH 值为7. 0 8. 0 时,可有效将伤寒Vi 多糖的杂质与纯化产物分离,多糖回收率分别为36. 52% 38. 35%,明显高于传统工艺的多糖回收率(15. 52%),且纯化产物的内毒素含量(10 EU /μg)明显低于传统工艺(200 EU/μg)。以优化工艺(pH 7. 0)纯化3 批伤寒Vi 多糖粗糖获得的6 批精糖的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大小、内毒素含量及多糖回收率差异较小,标准偏差均小于5%。结论优化了伤寒Vi 多糖柱层析的纯化工艺,该工艺稳定性良好,可替代传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法,应用于伤寒Vi 多糖的纯化。
 
伤寒是由伤寒沙门杆菌引起的一种急性肠道传染病,该病经肠道感染网状内皮细胞系统、肠道淋巴系统和胆囊而致急性全身性感染。我国自1998 年洪涝灾害后,伤寒发病率逐渐升高。据2008 年中国卫生部统计,伤寒或副伤寒的感染率为118/10 万,病死率约为0. 04 / 10 万,该病是中国发病率前十位的传染病之一[1]。WHO 推荐使用伤寒Vi 多糖疫苗预防伤寒的流行2。研究表明,大规模的使用伤寒Vi 多糖疫苗,可明显降低伤寒的流行,减轻社会的经济负担3-4
伤寒Vi 多糖的有效抗原为细胞壁外的荚膜多糖。传统纯化工艺多采用苯酚抽提、乙醇分级沉淀等方法,该方法所使用的提取试剂对环境污染严重,工艺的繁琐导致多糖回收率偏低。本实验对纯化条件温和的DEAE 阴离子交换层析法的pH 值进行了分析比较,建立一种步骤简单、纯化效果好、环境污染小的伤寒Vi 多糖柱层析纯化工艺,并对该方法的稳定性进行验证,以替代传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法,应用于伤寒Vi 多糖的纯化。
1 材料及方法
1. 1 样品4 批伤寒Vi 多糖粗糖(批号为STVi20111206STVi 20111207STVi 20120101 STVi20120102)由本公司发酵研究室提供。
1. 2 主要试剂及仪器Tris-Cl 和氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司;AKTA explorer 层析系统、DEAE 层析填料和XK26/20 层析柱均购自GE 公司。
1. 3 DEAE柱层析纯化采用AKTA exploere 层析系统,DEAE 填料柱体积为45 ml,用20 mmol/L Tris-ClpH 6. 07. 0 8. 0)缓冲液充分平衡DEAE柱。称取伤寒Vi 多糖粗糖(STVi 20111206300 mg,按5 mg/ml 溶解于20 mmol/L Tris-ClpH 6. 07. 0 8. 0)缓冲液中,经0. 45 μm 滤膜过滤后,按每毫升填料5 ~ 10 mg 样品上样于预处理好的DEAE 层析柱,流速为3 ~ 6 ml/min,用缓冲液A20 mmol/L Tris-ClpH 6. 07. 0 8. 0)]淋洗4 ~5 倍柱体积,用缓冲液B20 mmol/L Tris-Cl +0. 5 mol/L NaClpH 6. 07. 0 8. 0)]进行10 ~15倍柱体积的连续梯度洗脱。纯化过程分别用紫外206260280 nm 波长检测多糖、核酸及蛋白含量。收集穿透峰,除菌过滤后用注射用水透析48 h,置真空干燥,用于后续检测。
1. 4 传统工艺纯化参考《中国药典》三部(2010 版)5伤寒Vi 多糖疫苗)的方法纯化伤寒Vi 多糖粗糖(STVi20111206)。
1. 5 纯化样品的检测取适量纯化产物,用注射用水溶解,依据《中国药典》三部(2010 版)5对纯化产物的蛋白质含量(应小于10 mg/g)、核酸含量(应小于20 mg/g)、O-乙酰基含量(应不低于2. 0 mmol/g)、分子大小(多糖分子的KD 值在0. 25 以前的洗脱液多糖回收率应在50%以上)及内毒素含量进行检测,并进行览鉴别试验(Vi 多糖与伤寒Vi 血清产生明显沉淀线)。按下式计算多糖回收率。
多糖回收率(%= 精糖的收量(g/粗糖的投量(g)× 100%
1. 6 DEAE柱层析稳定性的检测采用优化的DEAE柱层析工艺纯化3 批伤寒Vi 多糖粗糖(STVi 2011-1207STVi 20120101 STVi 20120102),并对纯化产物进行相关项目的检测,计算标准差(SD)和变异系数(CV),验证该工艺的稳定性。
2 结果
2. 1 DEAE 柱层析纯化检测结果可见,上样缓冲液为pH 6. 0 20 mmol/L Tris-Cl 时,目的产物流穿,但核酸和杂蛋白未结合在层析柱上,随穿透峰一同穿出;上样缓冲液为pH 7. 0 20 mmol/LTris-Cl 时,目的产物流穿,核酸和杂蛋白结合于层析柱上,并随缓冲液B 梯度的增加逐渐被洗脱下来;上样缓冲液为pH 8. 0 20 mmol/L Tris-Cl 时,纯化效果与pH 7. 0条件下相似,见图1
2. 2 纯化样品的鉴定检测结果表明,DEAE 柱层析纯化缓冲液pH 值为6. 0 时无法有效去除伤寒Vi多糖中的杂蛋白及核酸,其纯化产物的蛋白质含量是pH 7. 0 pH 8. 0 条件下的17. 86 15. 37 倍,核酸含量是pH 7. 0 pH 8. 0 条件下的5. 25 6. 06倍,内毒素含量远低于传统工艺,仅为传统工艺的5%。见表1。传统工艺纯化多糖回收率为15%,而DEAE 柱层析工艺(pH 7. 0 pH 8. 0)纯化多糖回收率分别为36. 52%和38. 35%,见表2。由于伤寒Vi 多糖中含O-乙酰基,在碱性条件下O-乙酰基易脱落,因此,本实验选择pH 7. 0 为层析纯化的最佳条件。
2. 3 DEAE 柱层析的稳定性检测结果表明,以优化工艺纯化3 批伤寒Vi 多糖粗糖获得的6 批精糖的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大小、内毒素含量及多糖回收率差异较小,标准偏差均小于5%。表明该方法具有良好的稳定性。见表3 和表4
 
 
3 讨论
通常在离子交换层析中,pH、离子强度等条件是纯化效果的关键因素,本实验采用DEAE 柱层析纯化多糖是使纯化产物经层析柱后流穿,杂质结合于层析柱上,因此,离子强度对该纯化方法无重要影响。本实验重点是对层析柱的pH 值进行了优化。
实验结果表明,在缓冲液(20 mmol/L Tris-ClpH 6. 0 条件下未能将目的产物与杂质分离,在pH 7. 08. 0 条件下多糖流穿,大部分核酸及蛋白等杂质结合于层析柱上,并随缓冲液B 梯度的增加而被逐步洗脱下来,由于伤寒Vi 多糖中含O-乙酰基,在碱性条件下O-乙酰基易脱落,因此,选择pH 7. 0 作为伤寒Vi 多糖的最佳柱层析纯化条件。
为避免疫苗生产过程中苯酚等有毒化学试剂及高浓度乙醇、甲醇等易燃易爆的有机溶剂对疫苗质量的影响6-7,采用现代纯化技术对传统的生产工艺进行改进,减少或弃用有毒化学试剂,以提高疫苗产品质量。Pato 8探讨了流脑C 群荚膜多糖的柱层析纯化工艺,国内也报道层析法对流脑A 群荚膜多糖去杂蛋白的有效性9
伤寒Vi 多糖疫苗的有效抗原部分为荚膜多糖,通常提取荚膜多糖的方法是以Gotschlich 法为基础10,传统伤寒Vi 多糖的提取工艺多采用苯酚抽提、乙醇分级沉淀等方法5-6,11,但苯酚为有毒化学试剂,为该疫苗的使用带来一定的安全隐患,因此,本实验通过采用DEAE 离子交换层析,确定了缓冲液20 mmol/LTris-Cl pH 7. 0 DEAE 层析柱工艺的最佳条件,中性pH 值确保了多糖结构的稳定性,提高了纯化产物的质量指标,且明显降低了纯化产物的内毒素含量。
本实验采用优化的DEAE 柱层析工艺对3 批粗糖进行了纯化,实验结果显示,所得到的6 批精糖质量均符合规定,蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大小、内毒素含量及多糖回收率差异较小,标准偏差均小于5%,表明该工艺具有良好的稳定性,易于工艺放大,提高了疫苗的安全性及产品的质量标准,可替代传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法,应用于伤寒Vi 多糖的纯化。
 
 
参考文献
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